二甲戊灵诱导大蒜根尖染色体数目变化的实验探究

摘要:用二甲戊灵作为诱变剂诱导大蒜根尖染色体加倍,并与秋水仙素诱导法、低温诱导法对比,结果显示二甲戊灵处理的大蒜根尖,可观察到的中期分裂相多倍体细胞数目与秋水仙素处理效果相近,适合作为开展多倍体诱导实验的诱变剂。

关键词:二甲戊灵  染色体  多倍体  高中生物学实验

1 前言

“低温诱导植物细胞染色体数目的变化”是人教版2019年版生物学必修2《遗传与进化》中第5章第2节的内容。虽然新教材根据潘明山等的研究调整了实验方法,但极低的诱导率仍然让许多教师望而止步。目前最常用的秋水仙素又因为有剧毒,不适合在中学使用。近年来发现二硝基苯胺类除草剂也具有使染色体加倍的功效,诱导效果好,并且比秋水仙素的毒性小。国内目前已在西瓜、大蒜等作物的愈伤组织多倍体诱导获得成功。但缺少使用这类试剂诱导大蒜根尖染色体数目加倍的报导。

本实验以常用的二硝基苯胺类除草剂——二甲戊灵作为诱导剂,与秋水仙素诱导法和低温诱导法对比,以期为多倍体诱导实验提供安全有效的方法。

2 材料与方法

2.1 材料和试剂

大蒜鳞茎、秋水仙素、33%二甲戊灵乳油、卡诺氏液、酒精、10%HCl、1%NaHCO3、改良苯酚品红染色剂。

2.2大蒜根尖染色体加倍诱导

将4组大小相近的大蒜瓣分别串在牙签上,置于25℃恒温培养箱中,在盛有清水的烧杯中培养。待长出1 cm长的不定根时,将第一组放在0.05%秋水仙素溶液中处理24 h,第二组放在0.003%二甲戊灵溶液中处理24 h,第三组放在4℃的冰箱中处理72 h,第四组继续清水培养,作为对照组(图1)。处理结束后,将4组大蒜瓣换清水恢复培养24 h。接着将根尖剪断,第一、二组放入最初的诱导条件处理3 h,第三组处理24 h,以期得到更多的中期分裂相。最后将四组大蒜根尖放入卡诺氏液中固定1 h,再换到70%的酒精中储存。

大蒜根尖染色体加倍诱导

2.3 制片与观察

在清水恢复培养24 h后,观察根尖形态的变化。然后将固定好的大蒜根尖用10%HCl在60℃水解1 min,用蒸馏水漂洗一次,再用1% NaHCO3中和剩余的HCl 1 min。用改良苯酚品红染色5 min,边染色边用镊子将根尖夹碎,促进染色。接着盖上盖玻片,用拇指按压,使细胞分散。上镜观察,统计每一万个分生区细胞中处于中期的多倍体细胞数目,对典型细胞进行显微拍照。

3 结果与分析

3.1 大蒜根尖的外型变化

清水培养24 h后,秋水仙素诱导组和二甲戊灵诱导组的大蒜根尖明显出现了巨大化的现象,但低温诱导组并没有(图2)。推测秋水仙素和二甲戊灵诱导大蒜根尖产生了多倍体,而低温诱导可能没有。

大蒜根尖的外型变化

3.2 多倍体细胞的观察及中期分裂像数目统计

以形成清晰的染色体为判断依据(图3),对每种处理方式的根尖进行显微观察。发现秋水仙素组约每一万个分生区细胞中可以观察到488个中期多倍体细胞,概率为4.88%;二甲戊灵组概率约为3.97%;低温组没有观察到处于中期的多倍体细胞。虽然中期多倍体细胞概率略少于秋水仙素组,但二甲戊灵确实可以有效诱导大蒜根尖染色体数目加倍。低温几乎不能诱导大蒜根尖染色体数目加倍,这与潘明山等的结论不符。

大蒜根尖分生区细胞

图3 大蒜根尖分生区细胞

a. 秋水仙素诱导结果;b. 二甲戊灵诱导结果;c. 低温诱导结果;d. 对照组

4 讨论

低温诱导植物细胞染色体数目加倍的原理是通过抑制微管的装配,干扰纺锤体的形成,抑制着丝点分裂后的染色体移向两极,从而达到使染色体数目加倍的目的。但低温也使细胞周期延长。解除低温处理后,大部分细胞仍可继续正常进行有丝分裂,因此低温诱导产生多倍体的概率极低,中学难以成功开展低温诱导实验。而秋水仙素成本较高,且有剧毒(成人口服致死量为0.8 mg/kg),不适合中学实验教学使用。

二硝基苯胺类除草剂和秋水仙素一样能与微管蛋白结合,阻止纺锤体的形成,但并不影响着丝粒一分为二,从而诱导染色体数目加倍。作为代表的二甲戊灵不仅价格便宜,200 mL乳油仅需10元;而且毒性低,小鼠半致死剂量为1340~ 1620 mg/kg,日光下半衰期为6.9天,易降解,不会导致土壤、地下水的污染,对环境友好。从本研究结果来看,二甲戊灵处理效果较好,兼具毒性低、成本低的特点,适合作为高中生物实验中诱导多倍体的试剂。

笔者建议将该试验与必修1的“观察根尖分生区组织细胞的有丝分裂”实验一起开展。两位同学为一组,一位制作正常根尖临时装片,另一位制作多倍体根尖临时装片。两位同学相互对比显微观察结果,在教师的引导下进行科学推理和分析,更好地构建有丝分裂、染色体数量变异、多倍体诱导技术等重要概念,以科学探究促进科学思维的发展。